La lumière UV-C lointaine (222nm) inactive efficacement et en toute sécurité les coronavirus humains aéroportés.

Tableau : des exemples de distributions de la taille des particules provenant d'humains au cours de diverses activités sont donnés (Réf.26) ainsi que les valeurs moyennes mesurées pour ce travail.

Lampe UVC lointaine et dosimétrie

La source d'UV-C lointains utilisée dans cette étude était un module de lampe excimère KrCl de 12W 222nm fabriqué par USHIO America (article #9101711, Cypress, CA). La lampe est équipée d'une fenêtre de filtrage optique exclusive pour réduire les émissions de la lampe en dehors du pic d'émission de 222nm du KrCl. La lampe a été positionnée à 22cm de la fenêtre de la chambre d'exposition et dirigée vers le centre de la fenêtre. Les mesures de la puissance optique ont été effectuées à l'aide d'un photodétecteur en silicium amélioré par l'UV à faible puissance 818-UV/DB avec un wattmètre optique 843-R (Newport, Irvine, CA). La dosimétrie a été effectuée avant le début de l'expérience afin de mesurer la fluence à l'intérieur de la chambre à l'emplacement de l'aérosol.

La distance entre la lampe et la chambre d'irradiation a permis à une seule lampe d'irradier uniformément toute la zone de la fenêtre d'exposition. Les mesures effectuées à l'aide du photodétecteur en silicium ont indiqué une intensité d'exposition d'environ 90μW/cm² sur toute la zone d'exposition. La chambre est équipée d'une surface en aluminium réfléchissante opposée à la fenêtre d'exposition. Comme dans nos précédents travaux avec cette chambre (Réf.23), la réflectivité de cette surface était d'environ 15%. Nous avons donc estimé de manière conservatrice que l'intensité sur l'ensemble de la zone d'exposition était de 100μW/cm2. La lampe étant positionnée à 22cm de la fenêtre et compte tenu des 20 secondes nécessaires à une particule aérosol pour traverser la fenêtre d'exposition, nous avons calculé que la dose d'exposition totale à une particule était de 2 mJ/cm². Nous avons utilisé des feuilles supplémentaires de fenêtres en plastique transmettant les UV pour réduire uniformément l'intensité à travers la région d'exposition afin de créer différentes conditions d'exposition. Alors que dans nos travaux précédents avec ces feuilles, nous avons mesuré une transmission plus proche de 65% (Réf.23), pour ces tests, nous avons mesuré la transmission 222nm de chaque feuille à environ 50%. Cette diminution de la transmission est probablement due à la photodégradation du plastique au fil du temps (Réf.4). L'ajout d'une ou deux feuilles de plastique couvrant la fenêtre d'exposition diminue la dose d'exposition à 1 et 0.5mJ/cm², respectivement.

Protocole expérimental

Comme décrit précédemment (Réf.23), la solution virale dans le nébuliseur consistait en 1ml de milieu d'Eagle modifié (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) contenant 107-108 TCID50 de coronavirus, 20ml d'eau désionisée et 0.05ml de solution saline équilibrée de Hank avec calcium et magnésium (HBSS++). La chambre d'irradiation a fonctionné avec des particules virales en aérosol circulant dans la chambre et le canal de dérivation pendant 5 minutes avant chaque prélèvement, afin d'établir la valeur d'humidité relative souhaitée. Le prélèvement des échantillons a été initié en modifiant le flux d'air du canal de dérivation vers le BioSampler à l'aide d'un ensemble de vannes à trois voies. Le BioSampler a été initialement rempli de 20ml de HBSS++ pour capturer l'aérosol. Pendant chaque période d'échantillonnage, qui a duré 30 minutes, l'intérieur de la chambre d'irradiation a été exposé à une lumière UV-C lointaine de 222nm entrant par la fenêtre en plastique. La variation de la dose d'UV-C lointains délivrée aux particules d'aérosol a été obtenue en insérant des films plastiques transparents aux UV supplémentaires comme décrit ci-dessus, délivrant ainsi les trois doses d'essai de 0.5, 1.0 et 2.0 mJ/cm². Les études de contrôle à dose nulle ont été réalisées avec la lampe excimère éteinte. Une fois la période d'échantillonnage terminée, la solution du BioSampler a été utilisée pour les essais d'infectivité virale.

Tests d'infectivité virale

TCID50

Nous avons utilisé le test de la dose infectieuse à 50% sur culture tissulaire pour déterminer l'infectivité du virus (Réf.28). En bref, 105 cellules hôtes ont été placées dans chaque puits de plaques à 96 puits le jour précédant l'expérience. Les cellules ont été lavées deux fois dans du HBSS++ et des dilutions sérielles 1:10 dans le milieu d'infection du virus exposé provenant du BioSampler ont été superposées aux cellules pendant deux heures. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois dans du HBSS++, recouvertes de milieu d'infection frais et incubées pendant trois ou quatre jours à 34°C. Les effets cytopathiques (ECP) ont été notés au microscope à fond clair (10×) comme la vacuolisation du cytoplasme, l'arrondissement des cellules et la desquamation. La DICT50 a été calculée selon la méthode de Reed et Muench (Réf.28,38). Pour confirmer les scores de l'ECP, les échantillons ont été fixés dans du méthanol à 100% pendant cinq minutes et colorés avec du cristal violet à 0.1%. Les résultats sont rapportés en tant qu'estimation des unités formatrices de plaques (UFP)/ml en utilisant la conversion UFP/ml = 0.7 DICT50 en appliquant la distribution de Poisson (Réf.29).

Immunofluorescence

Pour évaluer si des doses croissantes de lumière de 222nm réduisaient le nombre de cellules infectées, nous avons effectué un protocole standard d'immunocoloration fluorescente pour détecter un antigène viral dans les cellules humaines hôtes (Réf.23). En bref, 2 × 105 cellules hôtes (cellules MRC-5 pour HCoV-229E et WI-38 pour HCoV-OC43) ont été placées dans chaque puits de plaques à 48 puits le jour précédant l'expérience. Après un passage dans la chambre d'irradiation pendant 30 minutes, 150μl de suspension virale recueillie dans le BioSampler ont été superposés sur la monocouche de cellules hôtes. Les cellules ont été incubées avec le virus pendant une heure, puis lavées trois fois avec du HBSS++, et enfin incubées pendant la nuit dans un milieu d'infection frais. Les cellules infectées ont ensuite été fixées dans du méthanol glacé à 100% à 4°C pendant 5 minutes et marquées avec une glycoprotéine de pointe anti-coronavirus humain (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) au 1:200 dans du HBSS++ contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA ; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) à température ambiante pendant une heure en agitant légèrement. Les cellules ont été lavées trois fois dans du HBSS++ et marquées avec de l'anti-souris de chèvre Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 dans du HBSS++ contenant 1% de BSA, à température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité avec une légère agitation. Après trois lavages dans HBSS++, les cellules ont été colorées avec du Vectashield contenant du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et observées avec l'objectif 10× d'un microscope à fluorescence Olympus IX70 équipé d'un appareil photo numérique à haute résolution et à haut rendement Photometrics PVCAM et du logiciel Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Pour chaque dose de 222nm et chaque genre de virus, les résultats représentatifs ont été répétés deux fois. Pour chaque échantillon, jusqu'à dix champs de vue d'images fusionnées de DAPI et d'Alexa Fluor-488 ont été acquis.

Analyse des données

La fraction survivante (S) du virus a été calculée en divisant la fraction PFU/ml à chaque dose d'UV (PFUUV) par la fraction à dose nulle (PFUcontrols) : S = PFUUV/PFUcontrols. Les valeurs de survie ont été calculées pour chaque expérience répétée et transformées en logarithme naturel (ln) pour rapprocher la distribution des erreurs de la normale (Réf.39). Une régression linéaire robuste utilisant les moindres carrés itérés repondérés (IWLS) (Réf.40,41) a été effectuée dans le logiciel R 3.6.2 en utilisant ces valeurs ln[S] normalisées comme variable dépendante et la dose d'UV (D, mJ/cm²) comme variable indépendante. Grâce à cette approche, la survie du virus [S] a été décrite par une cinétique de premier ordre selon l'équation (Réf.4) :

ln(S) = -k x D

où k est la constante de vitesse d'inactivation UV ou le facteur de susceptibilité (cm²/mJ). La régression a été effectuée avec le terme d'interception fixé à zéro, ce qui représente la définition d'une survie relative de 100% à une dose UV nulle, séparément pour chaque souche virale étudiée. Les données à la dose zéro, qui par définition représentent ln[S] = 0, n'ont pas été incluses dans la régression. Les incertitudes (intervalles de confiance à 95%, IC) pour le paramètre k de chaque souche virale ont été estimées par bootstrapping pour chaque méthode de régression, car le bootstrapping peut donner lieu à des estimations d'incertitude plus réalistes, par rapport à l'approximation analytique standard basée sur la normalité asymptotique, dans de petits ensembles de données comme ceux utilisés ici (n = 3 pour HCoV-229E et n = 4 pour HCoV-OC43). La qualité de l'ajustement a été évaluée par le coefficient de détermination (R2). L'analyse des résidus pour l'autocorrélation et l'hétéroscédasticité a été effectuée à l'aide du test de Durbin-Watson (Réf.42) et du test de Breusch-Pagan (mis en œuvre par le paquet R lmtest) (Réf.43), respectivement. Les estimations des paramètres (k) pour chaque souche virale ont été comparées entre elles sur la base des IC à 95% et directement par un test t, en utilisant les tailles d'échantillon, les valeurs de k et leurs erreurs standard. La section transversale d'inactivation du virus, D90, qui est la dose d'UV qui inactive 90% du virus exposé, a été calculée comme suit : D90 = - ln[1 - 0,90]/k. Les autres valeurs de D ont été calculées de manière similaire.

Disponibilité des données

Le fichier de jeu de données généré et/ou analysé au cours de la présente étude est disponible dans le dépôt Open Science Framework (OSF), identifiant : DOI 10.17605/OSF.IO/KGZAF.

Références

1. Organisation mondiale de la santé. Rapports de situation sur les maladies à coronavirus (COVID-2019).  Disponible sur : https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports (2020).
2. van Doremalen, N. et al. Aerosol and surface stability of sars-cov-2 as compared with sars-cov-1. N. Engl. J. Med, (2020).
3. Bai, Y. et al. Presumed asymptomatic carrier transmission of covid-19. JAMA, (2020).
4. Kowalski, W. J. Ultraviolet Germicidal Irradiation Handbook: UVGI for Air and Surface Disinfection. New York: Springer, (2009).
5. Budowsky, E. I. et al. Principles of selective inactivation of viral genome. I. UV-induced inactivation of influenza virus. Arch. Virol. 68(3-4), 239–47 (1981).
6. Naunovic, Z., Lim, S. & Blatchley, E. R. III. Investigation of microbial inactivation efficiency of a UV disinfection system employing an excimer lamp. Water Res. 42(19), 4838–46 (2008).
7. Trevisan, A. et al. Unusual high exposure to ultraviolet-C radiation. Photochem. Photobiol. 82(4), 1077–9 (2006).
8. Zaffina, S. et al. Accidental exposure to UV radiation produced by germicidal lamp: case report and risk assessment. Photochem. Photobiol. 88(4), 1001–4 (2012).
9. Setlow, R. B. et al. Wavelengths effective in induction of malignant melanoma. Proc. Natl Acad. Sci. USA 90(14), 6666–70 (1993).
10. Balasubramanian, D. Ultraviolet radiation and cataract. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 16(3), 285–97 (2000).
11. Narita, K. et al. 222-nm UVC inactivates a wide spectrum of microbial pathogens. J Hosp Infect (2020).
12. Buonanno, M. et al. 207-nm UV light - a promising tool for safe low-cost reduction of surgical site infections. I: in vitro studies. Plos One 8(10), e76968 (2013).
13. Buonanno, M. et al. 207-nm UV light-a promising tool for safe low-cost reduction of surgical site infections. II: In-Vivo Safety Studies. PLoS One 11(6), e0138418 (2016).
14. Buonanno, M. et al. Germicidal efficacy and mammalian skin safety of 222-nm uv light. Radiat. Res. 187(4), 483–491 (2017).
15. Ponnaiya, B. et al. Far-UVC light prevents MRSA infection of superficial wounds in vivo. Plos One 13(2), e0192053 (2018).
16. Narita, K. et al. Disinfection and healing effects of 222-nm UVC light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in mouse wounds. J. Photochem. Photobiol. B 178(Supplement C), 10–18 (2018).
17. Narita, K. et al. Chronic irradiation with 222-nm UVC light induces neither DNA damage nor epidermal lesions in mouse skin, even at high doses. PLoS One 13(7), e0201259 (2018).
18. Yamano, N. et al. Long-term effects of 222 nm ultraviolet radiation C sterilizing lamps on mice susceptible to ultraviolet radiation. Photochem Photobiol, (2020).
19. Goldfarb, A. R. & Saidel, L. J. Ultraviolet absorption spectra of proteins. Science 114(2954), 156–7 (1951).
20. Setlow, J. The molecular basis of biological effects of ultraviolet radiation and photoreactivation, in Current topics in radiation research, M. Ebert & A. Howard, Editors., North Holland Publishing Company: Amsterdam. p. 195–248 (1966).
21. Coohill, T. P. Virus-cell interactions as probes for vacuum-ultraviolet radiation damage and repair. Photochem. Photobiol. 44(3), 359–63 (1986).
22. Green, H. et al. Cytotoxicity and mutagenicity of low intensity, 248 and 193 nm excimer laser radiation in mammalian cells. Cancer Res. 47(2), 410–3 (1987).
23. Welch, D. et al. Far-UVC light: A new tool to control the spread of airborne-mediated microbial diseases. Sci. Rep. 8(1), 2752 (2018).
24. Fehr, A. R. & Perlman, S. Coronaviruses: an overview of their replication and pathogenesis. Methods Mol. Biol. 1282, 1–23 (2015).
25. Woo, P. C. et al. Coronavirus genomics and bioinformatics analysis. Viruses 2(8), 1804–20 (2010).
26. Papineni, R. S. & Rosenthal, F. S. The size distribution of droplets in the exhaled breath of healthy human subjects. J. Aerosol Med. 10(2), 105–116 (1997).
27. Sparrow, A. H., Underbrink, A. G. & Sparrow, R. C. Chromosomes and cellular radiosensitivity. I. The relationship of D0 to chromosome volume and complexity in seventy-nine different organisms. Radiat. Res. 32(4), 915–45 (1967).
28. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods Mol. Biol. 510, 329–36 (2009).
29. Mahy, B. & Kangro, H. Virology Methods manual. Academic Press (1996).
30. Bjorck, A. Numerical Methods For Linear Least Squares Problems. Computer Science (1996).
31. Walls, A. C. et al. Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114(42), 11157–11162 (2017).
32. Madu, I. G. et al. Characterization of a highly conserved domain within the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein S2 domain with characteristics of a viral fusion peptide. J. Virol. 83(15), 7411–21 (2009).
33. Modrow, S. et al. Molecular virology. Springer Berlin Heidelberg (2013).
34. Kangro, H. O. & Mahy, B. W. Virology methods manual. Elsevier (1996).
35. Walker, C. M. & Ko, G. Effect of Ultraviolet Germicidal Irradiation on Viral Aerosols. Env. Sci. Technol. 41(15), 5460–5465 (2007).
36. The International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection, Guidelines on limits of exposure to ultraviolet radiation of wavelengths between 180 nm and 400 nm (incoherent optical radiation). Health Phys, 87(2), p. 171–186 (2004).
37. ACGIH(R), 2017 TLVs and BEIs. Threshold Limit Value (TLV) for chemical substances and physical agents and Biological Exposure Indices (BEIs). Signature Publications (2017).
38. Reed, L. J. & Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27(3), 493–497 (1938).
39. Keene, O. N. The log transformation is special. Stat. Med. 14(8), 811–9 (1995).
40. Venables, W. N. & Ripley, B. D. Modern applied statistics with S. 4th ed. Statistics and computing, New York: Springer, xi, 495 p (2002).
41. Marazzi, A. Algorithm, Routines, and S functions for Robust Statistics. (Wadsworth & Brooks/cole, Pacific Grove, California, 1993).
42. Durbin, J. & Watson, G. S. Testing for serial correlation in least squares regression. I. Biometrika 37(3-4), 409–28 (1950).
43. Breusch, T. & Pagan, A. A simple test for heteroscedasticity and random coefficient variation. Econometrica 47(5), 1287–1294 (1979).

Remerciements

Ce travail a été entièrement soutenu par la Fondation Shostack et par la subvention R42-AI125006-03 du NIH. Nous remercions le Dr Alan W. Bigelow et Gary W. Johnson pour la conception initiale et la construction de la chambre à aérosols, ainsi que le Dr Gerhard Randers-Pehrson pour ses idées conceptuelles.

Informations sur l'auteur

Affiliations
Centre de recherche radiologique, Columbia University Irving Medical Center, New York, New York, 10032, USA

Manuela Buonanno, David Welch, Igor Shuryak & David J. Brenner

Contributions

M.B. a réalisé les expériences biologiques et analysé les données ; D.W. a réalisé l'installation de la chambre et la dosimétrie de la lampe ; I.S. a réalisé l'analyse statistique ; D.J.B. a supervisé les études et a fourni des conseils conceptuels. Tous les auteurs ont contribué à la préparation du manuscrit.

Correspondance avec l'auteur

Correspondance avec David J. Brenner.

Déclarations éthique

Intérêts concurrents
D.J.B. a obtenu un brevet intitulé "Apparatus, method and system for selectively affecting and/or killing a virus" (US10780189B2), qui concerne l'utilisation de lumière UV filtrée de 222 nm pour inactiver les virus. En outre, D.J.B. a une collaboration non financière en cours avec Eden Park Illumination, et l'institution des auteurs, l'université Columbia, a accordé une licence pour certains aspects de la technologie de la lumière UV à USHIO Inc.

Informations complémentaires

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